产品特点：

线粒体DNA（mtDNA）是进行分子进化研究和母性遗传研究的重要材料，但传统的两步式mtDNA提取方法是先温和裂解细胞，分离线粒体，然后再从线粒体中提取mtDNA。此方法中的温和裂解细胞的条件十分难以控制，需要针对不同组织材料单独进行优化。本方法克服了上述缺点，具有下列优点：

1. 不需要单独纯化线粒体，柱式法纯化，操作简单快捷。

2. 得到的mtDNA可以直接用于PCR和酶切。

3. 每107个动物细胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克组织一般能得到3-5 ug mtDNA。

4. 注意：本产品只适合于动物材料，不适合于植物材料，因为植物线粒体DNA一般都十分巨大，非常难提。

保存条件：

常温运输，短期可以在室温放置；长期保存放4℃

操作步骤：

一：培养细胞预处理

1. 用自备的0.25%胰酶消化液处理约107个培养细胞，离心收集后弃上清。

2. 用PBS或TBS等缓冲液洗涤细胞两次，离心得到的细胞沉淀直接用于mtDNA提取。

二：组织细胞预处理

3. 用剪刀将1g新鲜的动物组织剪碎（芝麻大小），转移到1.5mL塑料离心管中，用于mtDNA提取。注意：不要使用冻存的动物组织，因为冻凝过程中形成的冰晶会将线粒体刺破，使其DNA释放出来被胞浆中的DNA酶降解，影响回收率。

三：血液预处理

4. 将3-5 mL抗凝外周血静置30分钟或低速离心5分钟，取白细胞层。

5. 用自备PBS洗涤白细胞两次，得到的白细胞沉淀用于mtDNA提取。

四：mtDNA提取

5. 在细胞沉淀或剪碎的组织中加入250 uL冰浴的溶液A，充分吹打分散。如果是剪碎的组织，不要等成块的组织溶解即可继续下步操作。

6. 加入250 uL常温的溶液B（如果溶液B有沉淀，用前须37℃加热溶解后冷却到室温方可使用），温和反复颠倒混匀10次。千万不要剧烈振荡。

7. 冰上放置6-8分钟。注意不要超过8分钟。

8. 加入350 uL冰浴的溶液C，温和混匀4-6次，可见白色沉淀物产生，然后放冰上放置20-25分钟。

9. 室温12000-15000 g离心10分钟，小心将上清液转移到离心吸附柱中。由于此时的溶液比重较大，有时候出现沉淀漂浮是正常现象，取上清时避开漂浮的沉淀即可。

10. 静置5分钟以让DNA与离心吸附柱充分结合，此步十分重要。

11. 室温12000-15000 g离心1分钟，弃收集管中的废液。

12. 加入500 uL的通用洗柱液，室温12000-15000 g离心1分钟，弃收集管中废液。注意：通用洗柱液中含乙醇，用后需要将盖拧紧存放，否则乙醇会挥发。

13. 重复上步1次。

14. 室温12000-15000 g离心1分钟，甩干残留液体。此步不能省略，否则残留乙醇会影响DNA的后续使用（如DNA上样时不能沉淀到加样孔中）。

15. 将离心吸附柱置于一个新的1.5 mL塑料离心管中，加入30-50 uL 65-80℃预热的DNA洗脱液，室温放置2分钟。常温的DNA洗脱液也可以用于洗脱，但产量稍微有所降低。

16. 室温12000-15000 g离心1分钟，离心管底溶液即mtDNA。

17. 由于本公司离心吸附柱结合DNA能力较强，如果再加30-50 uL DNA洗脱液到离心吸附柱中，往往还能洗脱下很多mtDNA（相当于次洗脱的20-30%），但注意不要使用上步得到的mtDNA溶液来洗脱。

18. 12000-15000 g离心1分钟，离心管底溶液即线粒体DNA。每107个动物细胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克组织一般能得到3-5 ug mtDNA。如果DNA需要浓缩，可以使用本公司的核酸浓缩剂。

19. 由于DNA机械断裂，电泳时DNA可能不呈现专一的带，但此mtDNA溶液可以直接用于PCR。