产品特点：

Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)是目前电泳法变性分离多肽的主要方法，但是单独配制各种溶液十分繁琐，为此我们公司开发了本产品。它具有下列特点:

1. 一站式，提供除水和样品以外的所有成分。

2. 即开即用，用户不需单独准备各种成分，十分方便。

3. 安全，免去了实验人员接触粉末状的剧毒物品丙烯酰胺。

4. 电泳后可直接用于考染、银染、Western杂交等实验。

运输条件：

常温运输和保存（上样液需要-20℃保存），保存期为一年。

使用方法;

本公司强烈推荐在分离多肽时使用由4%浓缩胶、10%隔离胶和16%分离胶从上到下组成的三层Tricine-SDS-PAGE胶，下面为配制该胶的流程。如果用户不需要隔离胶或需要调整各胶的浓度，请稍作修改。

1. 配制30%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液（19：1）(丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液简称AB溶液，下同): 直接在装有60克丙烯酰胺干粉的塑料瓶中加入3克甲叉双丙烯酰胺干粉和140 mL自备的去离子水，拧紧瓶盖后37℃水浴，其间颠倒摇晃多次，直到干粉全部溶解，得到30% AB溶液（19：1），该溶液4℃避光保存，在一个月内用完。AB溶液具有神经毒性，一定要戴手套操作。

2. 配制10%的APS（过硫酸铵）：按每0.1克过硫酸铵干粉加1 mL去离子水的比例将去离子水加到装有硫酸铵干粉的1.5 mL EP管中，摇晃到粉末全部溶解。配制好的10%的APS溶液可在4℃存放一周

3. 配制30 mL 16%分离胶和9 mL 10%隔离胶（足够灌两块0.75 mm×14 cm×14 cm胶）。

A) 标记2个50 mL的三角瓶，按下表的用量加入各成分

B) 混匀后真空脱气10-15 分钟。

C) 在分离胶瓶中加入150 uL 10%的APS溶液和30 uL TEMED溶液，轻轻旋转混匀。

D) 灌胶。用一根巴斯德吸管，将分离胶溶液沿着一个隔条的边缘加到玻璃板夹层中，直到溶液的高度距离玻璃上沿还有5 cm。由于分离胶比重比隔离胶大，故可在其凝固前直接灌隔离胶。

E) 在隔离胶瓶中加入75 uL 10%的APS溶液和15 uL TEMED溶液，轻轻旋转混匀。

F) 灌胶。用巴斯德吸管，将积层胶溶液缓缓地沿着一侧隔条边缘加入到玻璃平板夹层中，直到溶液离玻璃板顶部约3 cm高为止。

G) 盖1cm高的水饱和的异丁醇使胶面跟氧气隔绝（氧气会抑制胶的凝固；此处水饱和的异丁醇可用水代替，但效果会差一些）。

H) 让分离胶和隔离胶在室温聚合30-45 分钟。

B) 混匀后真空脱气10-15 min。

C) 将75 uL新鲜配制的10%的过硫酸铵溶液和15 uL TEMED溶液加入到溶液中，轻轻旋转混匀。

D) 灌胶。用巴斯德吸管，将积层胶溶液缓缓地沿着一侧隔条边缘加入到

玻璃平板夹层中，直到夹层中的溶液离玻璃板顶部约1 cm高为止。

E) 插入0.75 mm厚的塑料梳子，再补加浓缩胶溶液填满梳子间的空隙。注意避免产生气泡。

F) 让浓缩胶在室温聚合30-45 分钟。

5. 小心拔出塑料梳子，在上层缓冲槽中加入1×阴极缓冲液，并用1×阴极缓冲液冲洗加样孔。注：本产品提供10 升的阴极缓冲液干粉，将所有干粉溶解在600-800 mL去离子水中，定容到1000 mL即得10×阴极缓冲液，可以室温放置，不需要灭菌，用时再用去离子水稀释10倍成1×阴极缓冲液。

6. 在电泳装置的下层缓冲液槽中加入1×阳极缓冲液。注：本产品提供10 升的阳极缓冲液干粉，将所有干粉溶解在600-800 mL去离子水中，用自备的浓盐酸调pH 到8.9（25℃）后定容到1000 mL即得10×阳极缓冲液，灭菌后可以4℃长期放置。用时再用去离子水稀释10倍成1×阳极缓冲液。

7. 在密封的螺盖微量离心管中，用2×Tricine-SDS-PAGE上样缓冲液按1：1的比例稀释蛋白样品，于100℃煮沸3-5 分钟。注意：如果样品是蛋白沉淀物，则加入50-100 uL 新配的1×Tricine-SDS-PAGE上样缓冲液溶解；如果样品是蛋白稀溶液，可先浓缩蛋白质。与Tricine-SDS-PAGE上样缓冲液混合后的样品如未经100℃加热灭活蛋白酶，切勿放于室温。

8. 上样。如果用考马斯亮蓝染色，对于成分复杂的蛋白质样品，上样量为20 uL（含25-50 ug总蛋白质）；对于只有一种或几种蛋白质的样品，上样量为1-10 uL。如果用银染，上样量可减少10-100倍。

9. 电泳。先30 V恒压电泳1 h（对0.75mm×14cm×14cm 的胶而言），然后150 V恒压电泳4-5 h。注：本产品的Tricine-SDS-PAGE上样液使用了考马斯亮蓝G-250作为指示剂，其泳动速度比的肽还快。

10. 终止电泳，取出凝胶进行后续的实验处理（用银染染色，节约样品）。注意：考染或银染时，基本步骤同蛋白电泳，但任何一步（尤其是固定步骤）的处理时间都不要超过20分钟，否则多肽非常容易扩散出PAGE胶而降低检测的灵敏度。