重组蛋白N端的GST谷胱甘肽S转移酶(Glutathione S Transferase)能提高重组蛋白的水溶性,所以常用于蛋白质重组表达。GST-谷胱甘肽亲和层析是利用GST标记的蛋白能与谷胱甘肽层析介质结合,并能被还原型谷胱甘肽洗脱的特点而建立,是目前分离纯化GST标记蛋白质的重要方法。本产品就是专门用于上述目的,具有下列特点:
1. 一站式套装,含所需的谷胱甘肽介质、溶液和层析柱,用户只需要提供表达GST标记蛋白的细菌(酵母、杆状病毒、培养细胞)即可,非常方便。
2. 专一性强,过柱即可获得纯度高达95%的GST-标记蛋白。
3. 只能在非变性条件下使用,只可用于纯化没形成包涵体的GST标记蛋白。
4. 每次可以处理20 mL的表达菌液,适合初步筛选和鉴定。
5. 提供4 mL 浓度为50%的谷胱甘肽-Agarose介质,可吸附5-10 mg GST标记蛋白质。
6. 本介质可以反复使用多次。
常温运输和保存,溶菌酶、Benzonase和PMSF需低温运输。收到货后,介质需4℃保存,溶菌酶、Benzonase和PMSF需-20℃保存,有效期一年
注意:
1. 每步得到的样品都留存少量作为SDS-PAGE分析的对照,在下面描述中就不再提醒。
2. 本实验需要用到的1×PBS缓冲液可用自备的超纯水稀释本试剂盒提供
注意:
1. 每步得到的样品都留存少量作为SDS-PAGE分析的对照,在下面描述中就不再提醒。
2. 本实验需要用到的1×PBS缓冲液可用自备的超纯水稀释本试剂盒提供
10. 将第7步得到的上清液(含可溶性GST标记蛋白)上柱,让重力使上柱液自然流出,收集并保存穿透液用于SDS-PAGE电泳。GST和谷胱甘肽之间的结合很缓慢,所以流速一定不能快,否则结合不充分。流速一般在0.2-1 mL/分钟即可。如要提高GST标记蛋白与介质的结合效率,可用本试剂盒提供的红盖将层析柱下的漏液口堵上,让细菌裂解液和介质在4℃结合30分钟或过夜。也可以将穿透液反复上柱。
11. 用0.5-2 mL 1×PBS缓冲液洗柱,收集并保存穿透液(含杂蛋白)。
12. 用0.2-1 mL GST洗脱液洗柱,收集并保存穿透液(含GST标记蛋白)。由于可能含蛋白酶污染,所以穿透液不能在4℃放置,需立即用于后续处理(如浓度测定或SDS-PAGE电泳)或-80℃长期放置。
13. 对收集的2种穿透液和洗脱液进行蛋白定量或SDS-PAGE分析。注意:如果不预先脱盐,则只能用Bradford法或OD检测法(1 OD280约等于0.5 mg/mL蛋白)测定穿透液和洗脱液的蛋白浓度。由于GST的分子量为26 KD,所以在SDS-PAGE胶上,GST标记蛋白将比天然蛋白大26 KD。