端粒酶存在于85-90%的肿瘤组织中，因此通过检测端粒酶活性就能早期诊断大多数肿瘤。目前常用的检测端粒酶活性的方法就是TRAP (telomeric repeat amplification protocol，端粒重复片段扩增)，它利用端粒酶能在外加的TS模板DNA的末端添加不同数量的TTAGGG序列这一特点，通过PCR检测延伸产物而高效检测端粒酶活性。本产品是我公司在经典TRAP技术基础上改良而得，专门用于快速测定人类细胞端粒酶的相对活性（需要跟对照样品比较）。它具有以下特征：

1. 一站式，提供从细胞裂解到PCR的所有试剂，但不含PAGE和银染试剂。

2. 一管式操作，端粒酶延伸和PCR在同一体系中完成，方便快捷。

3. 提供改良的、长为150 bp的内参和含8个端粒序列的合成端粒，可有效排除PCR假阴性。内参长度远大于TRAP产物，不会干扰结果分析。

4. 改良的TS模板和PCR引物，极大降低了引物二聚体的形成。

5. 既可用于培养细胞，也可用于实体组织。

6. 灵敏度高，可以检测到10个肿瘤细胞中的端粒酶活性。

低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一：端粒酶的提取

注意：端粒酶是蛋白质和RNA组成的复合体，RNA极容易被降解，因此，提取端粒酶应该跟提取RNA一样，尽量在低温条件下快速操作，并且必须使用RNase-free的耗材，桌面用固相RNase清除剂清洁（CAT#:3090）清洁。

1. 对冷冻的实体组织：将50-100 mg冷冻组织在液氮中用预冷的研磨器研磨成粉末，再转移到预冷的玻璃匀浆器中，加入200 uL 预冷的TRAP细胞裂解液，温和手动匀浆数次后冰浴30分钟，每间隔数分钟涡旋振荡，共5-6 次，然后直接进入第3步操作。为保证裂解效果，可在显微镜下观察。如果组织样品不足50-100 mg，可以按比例降低TRAP细胞裂解液的用量。

2. 对新鲜的培养细胞和组织：用自备的预冷PBS洗涤105-106个经过胰酶处理的细胞或50-100 mg新鲜组织，3000 g 4℃离心5分钟，弃上清；加入200 μL预冷的TRAP细胞裂解液悬浮细胞或组织。对细胞：涡旋振荡10秒后置冰浴30分钟，每间隔数分钟涡旋振荡，共5-6 次。对组织：在冰上用玻璃匀浆器轻柔匀浆后冰浴30分钟，每间隔数分钟涡旋振荡，共5-6 次。如果细胞不足1×106或50-100 mg，可按比例降低TRAP裂解液的用量。

3. 12000-14000 g 4℃离心20分钟。

4. 收集160 uL上清，先取部分用于测定蛋白质浓度，可通过测定215nm和225nm的光吸收得到，计算公式是蛋白质浓度（ug/uL）=0.144×（A215-A225）×稀释倍数，也可使用BCA法测定蛋白浓度。本试剂盒制备的细胞裂解物的蛋白浓度一般在10-750 ng/uL。知道各样品的蛋白浓度后，可用TRAP细胞裂解液将各样品的蛋白浓度调成一样便于比较，然后按10 μL/管分装得到至少15管裂解物，放-80℃冷冻保存（可存放一年）。每个样品可取一管进行热灭活（95℃处理10分钟）后再放-80℃冷冻保存，此管将作为该样品的阴性对照。

二：TRAP反应

5. 确定每个TRAP反应的细胞裂解物用量：为便于分析比较，每个TRAP反应所用的蛋白量（或细胞数）必须一样。由于细胞裂解物中一般都有高浓度的不明Taq DNA聚合酶抑制物（TRAP失败常见的原因），因此结果往往是用稀释10-1000倍后的细胞裂解物得到。建议用一个样品稀释不同浓度做TRAP预实验。

6. 在PCR管中按下表设置TRAP反应（50 uL反应体系，以A和B两个样品为例）

注：为避免污染，等其他样品加完并盖上盖后再加合成端粒。

7. 吹打混匀后进行PCR扩增，扩增条件（仅供参考，用户可优化）如下

三：PAGE-银染检测及结果解读（本试剂盒不含PAGE-银染检测试剂盒）

8. 取5uL PCR反应液进行10%非变性PAGE电泳-银染显色实验（需另购本公司PAGE电泳套装和银染试剂盒）。如果背景高（主要是由反应体系中的蛋白成分引起），可以先进行PCR产物纯化再进行PAGE电泳和银染。

9. 跟预期结果（见下表）比较。如果结果跟下表不一致，则需要按具体情况分析原因。

注：本试剂盒所用引物产生的典型TRAP条带条带为59bp。