储存条件
试剂盒请置于-20℃保存。
产品简介
RT-PCR是指利用逆转录酶将RNA逆转录（RT）成cDNA，然后以cDNA为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段的技术。RT-PCR技术可用于检测细胞和组织中基因表达水平，克隆特定基因的cDNA序列和检测RNA病毒。
本试剂盒采用一步法使RT和PCR在同一反应体系中进行,反应过程中不需要添加试剂，无需打开管盖，避免了污染，同时提高了检测的灵敏度。One??Step RT-PCR Kit(一步法试剂盒)采用高质量逆转录酶( R Tase) 和HotMaster Taq DNA聚合酶，并采用我公司的反应体系保证RTase和Hotmaster Taq发挥功效。
需自备的试剂
1 分子生物学实验级别的水（无核酸酶）
2 RNA模板
3 特异性PCR引物
使用注意事项
1. RNA 模板可以采用总RNA 或mRNA。
2. 经实验证明：针对复杂模板低丰度的基因，50 μl体系加入终浓度为0.5 μM Oligo dT能够
适当提高扩增效率。
3. 经试验证明：针对某些复杂模板或高GC含量低丰度的基因片段的扩增可以通过调整反转
录温度来达到很好的扩增效果。
4. 一步法RT-PCR 实验应避免RNase污染，可采用以下措施：
1） 因人的皮肤表面和唾液都有RNase，因此实验中应戴性手套和口罩；
2） 一步法RT-PCR 实验应使用专门的仪器和耗材，建议在专门区域操作RNA；
3） 一步法RT-PCR 实验相关耗材应用0.1％ DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12
h,并高压灭菌30 min后使用。
5. 本试剂盒 RTase、RNasin 和 Hotmaster Taq聚合酶在取用之前应短暂离心收集溶液后再吸
取，吸取时动作要慢，使用后应尽快放回-20℃。
6. dNTPs 应避免反复冻融以免失效。
7. 本试剂盒必须使用特异性引物，引物的选择可根据具体实验来选择。
8. 为避免非特异扩增，一步法反应液的配制应始终在冰浴中进行，待PCR仪器温度达50℃
时再将反应管放到仪器中。
9. 引物设计的好坏直接影响到RT-PCR 反应的结果，设计引物时需考虑GC含量，引物长
度，引物位置等因素，建议采用的引物设计软件来设计。
实验操作步骤
1. 完全融化模板RNA，特异性引物，Super Pure dNTPs, 10×RT-PCR Buffer, RNase-Free
ddH2O和5×RT-PCR Enhancer，短暂离心后置于冰浴上。
2. 按下表在冰浴条件下配制反应液：
组成成分 体积／反应
10×RT-PCR Buffer 5 μl
Super Pure dNTPs (10 mM each) 2 μl
5×RT-PCR Enhancer 10 μl
RNasin (40 U/μl) 0.5 μl
Hotmaster Taq Polymerase (2.5 U/μl) 2.5 μl
RTase (for one step) 0.5 μl
上游特异性引物(10 μM) 3 μl
下游特异性引物(10 μM) 3 μl
RNA模板 10 ng-1 μg total RNA
RNase-Free ddH2O 补水至50 μl
总体系 50 μl
注意：当同时需要进行多次RT-PCR反应时，将各组分加倍混合后再分装到每个反应管中，
可以减少实验操作产生的误差，使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失。
3. 启动PCR仪器直到温度上升至50℃时，将反应管放入PCR仪器中。
4. 按下表设置PCR反应条件：
步骤 反应 时间 温度
1 反转录反应 30 min 50℃
2 PCR初始变性 2 min 94℃
3 变性 0.5-1 min 94℃
4 退火 0.5-1 min 50-60℃
5 延伸 0.5-2 min 65℃
6 从3-5步进行30-40个循环
7 终延伸 10 min 65℃
5. 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。