产品及特点：

植物线粒体是重要的植物细胞器，负责ATP 的产生。此外植物很多重要的特性(如雄性不育)也跟线粒体相关，是母系遗传研究的重要材料。对植物线粒体进行生化和遗传研究都需要进行线粒体纯化。本产品就是专门用于植物细胞线粒体纯化的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即用型试剂盒，用户不需要单独配制各种溶液。

2. 提供AB 两种进过优化的操作方法，A 法利用常规台式冷冻离心机的差速分离原理进行线粒体粗提，所得线粒体含少量其他细胞器污染，可用于后续的SDS-PAGE，Western，ELSIA 和蛋白组分析，也可以用于PCR 级别的线粒体DNA 和RNA 提取。

3. B 法利用冷冻超速离心（离心力达40000g）制备的密度梯度来将线粒体粗提液中的线粒体和其他细胞成分进一步分开，得到线粒体精提液，适用于后续的偶联分析、体外线粒体蛋白合成、线粒体成份定位等精细实验。也可用于后续的SDS-PAGE、Western、ELSIA、蛋白组分析和测序级别的线粒体DNA 和RNA 提取。

4. 本产品足够5 次提取，每次可处理10g 绿色植物组织（可得1-2.5 mg 左右线粒体）或20g 非绿色植物组织（可得2-5 mg 左右的线粒体）。

常温运输和保存, 保存期限一年。

使用方法：

注意：线粒体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行，所用植物组织，器皿和溶液均需要在4℃预冷。任何情况下线粒体的温度都不要超过4℃。

一：选择组织

1. 植物组织不同，线粒体产率不同，请以下表为参考：

植物组织种类线粒体产率说明根和块茎0.3 mg/10g 如土豆，红薯等黄化苗（下胚轴、子叶、胚芽鞘） 2-5 mg/10g 多酚含量低于叶片有光合作用的叶片和子叶1-2.5 mg/10g 需放置在暗处3 天2. 一般纯化选用用黄化苗。如果用绿色组织（如叶片），需将植物提前放在暗室至少3 天以降低淀粉含量，否则淀粉颗粒将干扰线粒体的纯化。

3. 实验需要40 mL 匀浆液、约90 mL 洗涤液和35 mL 梯度离心介质。这些溶液用前均需要加入BSA 干粉使其终浓度为0.1%（100mL 溶液加0.1gBSA 干粉，轻柔颠倒混匀或搅拌溶解后放冰上预冷待用）。每次实验用多少配多少，不要预先将所有BSA 干粉加入，否则容易长菌。

二：线粒体粗提（A 法）

1. 将10 g 的绿色植物组织（如去叶脉后的嫩叶子，愈伤组织）或20 g 干净的非绿色植物组织（如发芽组织、根、块茎等）浸泡在冰水中10 分钟，用纸吸干液体后浸泡在预冷的40 mL 匀浆液（需先加0.1% BSA）中，在浸泡状态下剪成1cm2 大小的碎片。注意：如果样品可分成多组平行处理，得到线粒体粗提物后再汇集，否则线粒体产率将急剧降低。

2. 将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到Waring 匀浆器中，中速匀浆3 次，每次15 秒，每次之间间隔10 秒以便让碎片沉淀下来到刀片处。也可使用研磨法。具体操作是将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到预冷的研钵中，研磨3-4 分钟。注意：植物组织匀浆后释放的物质会使匀浆液酸化，降低pH，而线粒体对pH 变化非常敏感，因此建议匀浆后用pH 试纸检测匀浆液的pH，如果低于7.0，必须用自备的5 M KOH 将pH 调到7.0 以上才进入下一步。

3. 用带柄尼龙筛过滤匀浆液，穿透液可通过预冷的漏斗收集到预冷的50 mL 的塑料离心管中。

4. 在低速固定角度冷冻离心机上4℃ 1000 g 离心5 分钟，沉淀为未破碎的细胞、破碎细胞的碎片、细胞核和淀粉颗粒，上清含线粒体。小心转移上清到新的预冷的50mL 塑料离心管中。

5. 将装上清的离心管在水平冷冻离心机上4℃ 12,000 g 离心20 分钟，弃上清液，所得棕绿色沉淀即为纯化的线粒体粗提物。有时沉淀底部还有白色的淀粉沉淀，属于正常现象。

6. 加入10 mL 预冷的洗涤液（需先加0.1% BSA，下同）中，用软毛笔轻柔重悬线粒体沉淀(如果地下有白色淀粉沉淀，需要避免重悬之)。不能剧烈震荡，否则线粒体容易破裂。

7. 将线粒体重悬液转移到新的50mL 离心管中，再加入30mL 预冷的洗涤液（终体积为40 mL）中，4℃ 1000 g 离心5 分钟。线粒体将在上清中。

8. 将上清转移到新的预冷的50mL 离心管中，4℃ 12000 g 离心20 分钟，沉淀为线粒体。小心弃上清。到此步时，线粒体回收率一般在15-30%。

9. 在沉淀中加入2 mL 预冷的洗涤液。用软毛笔轻柔重悬，得到线粒体粗提液。

如果有平行提取，可将多4 管线粒体沉淀重悬在2 mL 洗涤液中。线粒体粗提液中线粒体的回收率一般在45-75%。

10. 所得线粒体粗提液含其他细胞器（如类囊体膜, 质体, 过氧化物酶体， 乙醛酸循环体,或细菌）污染，但可直接用于PCR 级线粒体DNA 和RNA 的提取、呼吸链功能测定，、蛋白浓度测定和线粒体精提。如果需要长期保存，则可以在线粒体重悬液中加入1/20 体积的自备DMSO，混匀后分成0.5 mL/管，然后放-80℃保存。如此保存的线粒体酶活性和膜完整性在几年内都不会发生变化。

三：细胞核DNA 的去除（纯化测序级的线粒体DNA 才需要进行此操作。本产品不提供相关试剂，实验步骤仅供参考）

11. 预留50uL 线粒体粗提液做对照，在约2 mL 剩余的线粒体粗提液中加入40uL 25mM 的MgCl2，再加入200ug DNase 干粉或溶液（总量为200ug即可），混匀后冰上放置60 分钟降解DNA。取少量样品（如50uL）在PCR仪器中加热到95℃变性10 分钟，再取其中的10uL 和10uL 预留的样品一起进行细胞核基因专一性PCR，如果DNase 处理的样品没有扩增，而预留样品有扩增，则表明DNA 去除比较干净（达到PCR 检测的极限），则进入下一步。如果未去除干净，则继续在冰上放置，直到PCR 检测不到细胞核DNA。

12. 加入0.32 mL 预冷的0.5M 的EDTA 溶液和40mL 预冷的洗涤液。

13. 4℃ 1000 g 离心5 分钟，将上清转移到新的预冷的50mL 离心管中，4℃12000 g 离心20 分钟，沉淀为去除细胞核DNA 的线粒体。重悬在2mL 洗涤液中。

四：线粒体精提（B 法，需要40000g 的超速冷冻离心机）14. 在50 mL 预冷的塑料离心管中先后加入35 mL 预冷的密度梯度离心介质（需先加0.1% BSA）。

15. 将2 mL 线粒体粗提物重悬液铺在密度梯度离心介质上。

16. 在超速水平离心机上4℃ 40,000 g 离心45 分钟，上层为黄色或橙色的质体带（如果材料是绿色植物，此带将是绿色），其下的白色不透明的带即为线粒体，管底沉淀为过氧化物酶体。其示意图如下：

17. 用广口吸管（可将1 mL 蓝抢头中间剪断后使用）收集线粒体带，注意避开其上的质体带过氧化物酶体沉淀，估计所取含线粒体溶液的体积。

18. 在15-20 分钟的时间内缓慢加入至少4 倍体积的预冷的洗涤液。

19. 转入50 mL 塑料管离心管中，在冷冻离心机上4℃ 15,000 g 离心20 分钟，沉淀为线粒体。

20. 将线粒体沉淀用软毛笔小心重悬在至少4 倍体积的预冷的洗涤液中，在冷冻离心机上4℃ 15,000 g 离心20 分钟，弃上清，沉淀即为洗涤后的线粒体精提物。到此步时，线粒体回收率一般在5-15%。

21. 将精提的线粒体重悬在1mL 预冷的洗涤液中。重悬的线粒体可以立即使用，在冰上多可放置5-6 小时。如果需要长期保存，则可以在线粒体重悬液中加入1/20 体积的DMSO，混匀后分成0.5 mL/管，然后放-80℃保存。如此保存的线粒体酶活性和膜完整性在几年内都不会发生变化。

五：线粒体后续处理（本产品不提供相关试剂，实验步骤仅供参考）

22. DNA 提取：离心得线粒体沉淀，再按常规的SDS-蛋白酶K 酶解，酚氯仿抽提，乙醇-盐沉淀的方法制备线粒体DNA。

23. RNA 提取：离心得线粒体沉淀，再按常规的Trizol 方法制备线粒体RNA。

24. 总蛋白提取：按细菌总蛋白提取方法。

25. 线粒体内膜，外膜、基质纯化：需要从本公司定做相关产品。

26. 其他功能检测：需咨询本公司技术人员是否可以定做相关试剂。