产品特点：

本产品专门从各种软骨组织样品中快速提取总RNA的试剂盒，它能有效克服传统TRIzol方法提取软骨组织RNA时，十分容易产生糖蛋白和酸性多糖污染这一缺点。

1. 能有效去除糖蛋白、粘蛋白污染，OD260/280一般均在1.9以上。

2. RNA产率一般为5-15 ug/100 mg。

3. 操作简单，整个提取过程一般只需要10多分钟。

4. 得到的RNA可以直接用于RT-PCR、Northern杂交、mRNA纯化、Primer Extension、RNA Protection、in vitro translation等研究。

常温运输，4℃保存，有效期一年。

使用方法：

1. 先将50-200 mg新鲜或冷冻的软骨组织液氮研磨成粉，加入1 mL溶液A（使用前必须放在65℃水浴使沉淀彻底溶解）溶解，然后将研磨物转移到新的1.5 mL离心管中, 振荡混合30秒。也可以将软骨组织剪碎后与溶液A一起匀浆，再转移到离心管中。

2. 在装有研磨物/匀浆物的离心管中加入0.3 mL的溶液B，振荡器振荡30秒混匀。注意：振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。

3. 加入0.2 mL自备氯仿，振荡器振荡30秒混匀。注意：振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。

4. 室温12000-15000 g离心2-5分钟。

5. 将上清液(约0.8 mL)转移到另一干净的1.5 mL塑料离心管中，下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质，避免触及或吸取。留下100 uL上清液不取。

6. 在上清液中加入0.5 mL的溶液C，振荡器振荡30秒混匀。注意：振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。

7. 加入0.2 mL的自备氯仿，振荡器振荡30秒混匀。注意：振荡器振荡时必须

使管底溶液震荡起来。

8. 室温12000-15000 g离心3分钟，两相间将有白色膜状物(蛋白质)形成。

9. 将上清液(约1 mL)转移到另一干净的1.5 mL塑料离心管中，避免触及或吸取有机相及其上面的白色膜状物。

10. 在上清液中加入0.5倍体积的溶液D，振荡器振荡30秒混匀，此时溶液呈白色浑浊状。注意：振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。

11. 室温12000-15000 g离心5-10分钟，RNA将在管底形成白色沉淀（约黄豆大小）。如果组织样品量少或需要提高RNA回收率，也可以延长离心时间到20-30分钟。

12. 在离心管中加入1mL 75%的乙醇，振荡器上振荡混匀30秒。

13. 室温12000-15000 g离心5分钟，RNA将在管底形成细小沉淀（约芝麻大小）。

14. 重复上步75%的乙醇洗涤，RNA将在管底形成细小沉淀。

15. 小心吸弃上清液，注意不要吸弃RNA沉淀。

16. 再短暂快速离心，用移液枪小心吸弃残留液。注意：不要吸弃沉淀。此步将有效去除残留的乙醇，否则后续反应会受到影响。

17. 加入适量(一般为20-50 μL) RNase-free水使RNA沉淀溶解，存放于-80℃或立即使用。千万不要用真空离心法使RNA沉淀过于干燥，否则RNA将变得十分难溶。

18. 检测

a） RNA完整性的电泳检测

如果需要做Northern杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA分子（BioTechniques，28：414，2000）。如果是简单检测，可以使用TAE或百奥莱博的SuperBuffer-2 DNA/RNA两用快速电泳液，但文献报道必须使用变性上样液（BioTechniques，9：558，1990）。普通DNA上样液不含变性剂，也没经过去RNase处理，所以不要使用。

尤其需要注意的是不要使用TBE进行RNA电泳，因为TBE所含硼酸是研究多糖的经典方法----硼酸络合法中的关键成分，硼酸通过与RNA核糖中的羟基发生络合反应，形成RNA分子内或RNA分子间的络合复合物，使同样长度的RNA具有不同的泳动速度，电泳条带弥散，同时有大的RNA络合复合物迟留

在加样孔中（一般会误以为是基因组DNA污染）。RNA分子内或RNA分子间的络合物的形成的多少和比例又与硼酸与RNA的数量比例有关，而RNA样品中污染的其他多糖也会参与此反应，使硼酸对RNA电泳的影响更复杂，所以TBE对RNA电泳的影响没有规律性和重复性。有的样品可以使用有的又不行，是避免使用。

由于动物细胞中70-80%的RNA为rRNA，后者又由28S (约4800 nt)，18S (约1900 nt)和5.8S (约120 nt)三种组成，所以变性胶电泳后应该在UV下看见三条清晰的rRNA带。由于核酸长度与结合EB的数量成正比（当然还与RNA的二级结构有关，双链部分结合能力比单链部分强），所以28S rRNA条带的荧光强度一般比18S rRNA条带的荧光强度强1.5-2.3倍。如果这两条rRNA带不清晰或比例小于此范围则表示RNA有降解（因为大的RNA被酶降解的可能更大）。

b） RNA产量产率测定

将5-10 μL RNA溶于TE缓冲液中(pH7.5-8.2之间)检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度（1 OD260的RNA=40 μg/mL），进而计算出RNA的产量（浓度X体积)和产率(RNA产量/组织用量)。

注意不要将RNA稀释在DEPC水中检测OD260和OD280，否则光吸收比在TE中测得的低10%-15%。

c） RNA纯度测定

无污染的总RNA的OD260/OD280一般在1.8-2.1之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，OD260/OD230一般在2.0-2.3之间，如果低于或高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质或多糖的污染，但一般不影响RT-PCR等反应。蛋白质污染可以通过酚/氯仿抽提然后酒精沉淀去除，DNA和多糖污染可以分别用百奥莱博的DNA Erasol 和PS Erasol去除。