易错PCR(error-prone PCR)是利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的特性,在一定条件下(如不同的dNTP浓度、Mg浓度和MnCl2存在)能够按较高的机率引入随机引入突变。如果有适当的选择方法,则可从构建的突变库选出所需突变体。
本产品就是专门为广大的研究工作者进行易错PCR而开发,本产品具有下列特点:
1. 即开即用,十分简单方便,尤其在生物制药和酶学研究领域显示出了它的优越性。
2. 配方经过精心优化,突变率稳定,突变没有趋向性。易错PCR的突变率为0.66%(±0.13%),详见使用手册疑难解答。
3. 比体内基因突变更快捷简单,但如果在PCR引物中设计位点,则可使产物克隆到表达载体,也可以用于体内蛋白活性的筛选。
4. 可用于连续易错PCR(sequential error-prone PCR),只需把上易错PCR的产物用作下易错PCR的模板即可,使每获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
5. 只适用于扩增1kb以下的产物,对于1kb以上的产物,建议分段扩增。
低温运输,-20℃保存, 有效期为一年。
1. 以30 uL的标准PCR反应体系为例,如果反应体系不是30 uL,各成分需要等按比例增加或减少。在一干净的PCR管中,加入下列成分:
易错PCR Mix, 10×
3 uL
易错PCR 专用dNTP, 10×
3 uL
MnCl2, 5 mM
3 uL
自备DNA模板(10ng/uL)
1 uL
PCR引物(自备,10 uM each)
10 pmol each
Taq DNA聚合酶(5U/uL)
1 -5 U
补水到
30 uL
2. 按已经优化的PCR条件进行一定循环数的PCR(循环数与突变率的关系见下表),然后取5 uL电泳检查。如果没有优化的PCR条件,一般可以先尝试下面的PCR条件:
PCR前变性
94℃ 3分钟
易错PCR
94℃ 1分钟
45℃ 1分钟
循环30次(见注)
72℃ 1分钟
注:易错PCR一般不需要热启动,也不需要在PCR结束后做延伸处理。
循环次数与突变几率的关系
易错PCR循环次数决定每个核苷酸位置的突变几率,进而决定每个PCR产物可能得突变位点数,所以所需循环数由客户根据需要改动。
3. 电泳检测是否得到预计长度的PCR产物。