产品特点:
本产品是专门用于各种藻类样品RNA提取的产品,它具有下列特点:
1. 操作简单快捷,整个过程只需要约30分钟。
2. RNA纯度高,OD260/280一般都在2.0左右,可直接用于RT-PCR、Northern杂交、microarray hybridization、cDNA合成等。
3. RNA产量高,一般在20-70 ug/mL液体藻类培养物(约2.0 ×107个细胞)。
4. 非酶细胞破裂法,适用于各种形态的藻类和各个种属的藻类。
常温运输,4℃保存,有效期一年。
使用方法:
1. 将 1-5 mL液体藻类培养物在1.5 mL塑料离心管中5,000-7,000 rpm 4℃离心 1分钟,并弃尽液体培养基(可以分多次离心)。
2. 加入0.5 mL溶液A并充分吹打混匀。注意:溶液A存放时容易产生沉淀,如果有沉淀,用前请置于65℃融化并充分摇晃均匀。
3. 加入0.5 mL溶液B,剧烈振荡30秒。
4. 65℃保温5分钟。注意:不要超过5分钟,否则RNA容易降解。
5. 5,000-7,000 rpm 4℃离心3-5分钟,转移上清到一自备的、干净的1.5 mL塑料离心管中。
6. 在上清液中加入0.2 mL自备的氯仿,充分振荡30秒混匀。
7. 4℃ 5,000-7,000 rpm离心3-5分钟,转移上清液到一自备的、干净的5-10 mL塑料离心管中。
8. 加入相当于上清液(约1 mL左右)3倍体积的溶液C和1倍体积的溶
液D,充分混匀。如果上清为1 mL,则加入3 mL溶液C和1 mL溶液D。
9. 将混合液分多次转移到离心吸附柱中,每次转移0.7mL混合液到离心吸附柱中,室温放置2-3分钟以让RNA跟吸附膜充分结合,然后5,000-7,000 rpm室温离心30-60秒,弃收集管中的穿透液,然后再加入0.7 mL混合液,重复上面的操作,直到混合液全部挂柱。
10. 次洗涤:将0.7 mL通用洗柱液加到离心吸附柱中,室温离心半分钟,弃收集管中的穿透液。
11. 第二次洗涤:洗涤一般足够去除杂质,但如果样品OD260/280比值不高,可以再用0.3 mL通用洗柱液重复上步洗涤。
12. 室温离心空柱子(带收集管)半分钟。此步十分重要,否则残留的通用洗柱液会影响RNA的使用。
13. 将离心吸附柱转移到一自备的RNase-free 1.5 mL塑料离心管中,加入30-100 uL RNA洗脱液。具体加多少根据RNA浓度决定,建议先使用小体积洗脱液,这样浓度过高还可以稀释。
14. 室温离心半分钟,离心管中溶液即为RNA样品,可以立即使用或存放于-80℃待用。
15. RNA完整性的电泳检测:
注意:普通DNA上样液不含变性剂,更没经过去RNase处理,所以不要用于RNA电泳。
16. RNA产量和纯度产率测定:
将5-10 uL RNA溶于TE缓冲液中(pH7.5-8.2之间)检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度(1 OD260的RNA=40 μg/mL),进而计算出RNA的产量(浓度×体积)和产率(RNA产量/细菌用量)。注意不要将RNA稀释在DEPC水中检测OD260和OD280,否则光吸收比在TE(pH7.5-8.2之间)中测得的低10%-15%;也不要稀释过度,使OD读数在仪器的有效范围之外,这样得到的OD比值没有意义。