尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Urea PAGE)是目前分离200 nt以下的小片段RNA，尤其是20 nt左右的microRNA(miRNA)分子的主要方法，但是单独配制各种溶液十分繁琐，为此我们公司开发了本产品。它具有下列特点:

1. 一站式，含有电泳所需要的所有试剂，即开即用，十分方便，免去了实验人员称取有毒物品。

2. 灵活，可以根据需要配制各种浓度的Urea-PAGE，以便对长度各异的RNA进行电泳。

3. 电泳后可直接用于UV观察、银染、胶回收、Northern杂交和放射自显影等。

4. 使用新型缓冲液，可以防止甘油的干扰。

常温运输、4℃保存（miRNAon、miRNA Marker需要-20°C保存）。保存期为一年。

使用方法：

一、准备工作

1. 用固相RNase清除剂清洁工作的台面和器皿（详见该产品的使用手册）。

2. 配制1 X电泳缓冲液

将适量的10X电泳缓冲液用RNase-free水稀释10倍，得到1X电泳缓冲液待用。

3. 配制10%过硫酸铵溶液

称取约100 mg过硫酸铵到一干净的1.5 mL离心管中，按每1 mg过硫酸铵加10 uL RNase-free水的比例加入RNase-free水，摇晃致溶，

立即使用。注意：放置时间不要超过一周。

二、配制凝胶

1. 估计所需要的凝胶溶液的体积，一般配制一块13 cm X 15 cm X 0.8 mm的胶需要15 mL凝胶溶液，配制一块36 cm X 45 cm X 0.8 mm的胶需要120 mL凝胶溶液。

2. 根据所需要的凝胶溶液的体积，在一的干净的三角瓶中按下表加入各成分（此处以配制100mL浓度为15%的凝胶为例）

3. 搅拌并加热到40-50℃左右，直到尿素完全溶解。

4. 冷却到室温后，将三角瓶接上真空系统抽真空处理10-15分钟以充分去除溶液中的氧气（氧气会降低聚合反应效率）。但如果实验条件有限，此步也可以省略。

5. 边摇晃溶液变加入50 uL TEMED和500 uL 10%过硫酸铵。注意：即使选择其他工作浓度的Acrylamide/Bis，TEMED和10%过硫酸铵的用量也不需要随之改变。但如果配置的凝胶溶液的体积变化，TEMED和10%过硫酸铵的用量也要按比例改变。

6. 再充分摇晃约30秒后迅速灌胶，然后插入样品梳。

7. 室温放置30-60分钟使胶凝固。

8. 将凝胶板放置在电泳装置上后，在上下层分别加入适当量的1X电泳缓冲液。如果不马上使用，需要有湿纸将上样孔端盖住以防凝胶过度干燥。

9. 拔出梳子后用加样枪吸取电泳缓冲液，充分将每个加样空中未聚合的Acrylamide/Bis、尿素和气泡吹打出来。

三、电泳

1. 在上样前，预电泳 20-30 分钟以使多余的过硫酸铵跑出加样空，同时还可以使凝胶的温度升高（到 50℃左右），有利于 RNA 电泳时维持在变性状态。预电泳电流见下面第 5 条。

2. 将 miRNA 样品与等体积的 miRNAon 混合，70℃保温 2-3 分钟后迅速放置在冰上冷却，快速离心半分钟，放冰上待用。

3. 关电泳仪后开始上样。注意：每次上样后如果不更换枪头，则需要充分吹打洗净枪头以防样品的交叉污染。

4. 同时上样 miRNA Marker。

5. 重开电泳仪，对 13 cm X15 cm 的胶，以 20-30mA 的电流电泳，直到红色染料移动到凝胶边缘为止；对 36 cm X 45 cm 的胶，则以 50-60mA的电流电泳，直到红色染料移动到凝胶边缘为止。

6. 四、后续处理

1. 染色观察：将凝胶一面的玻璃板揭开，直接用仍然附着在另一玻璃板上的凝胶进行各种染色，包括银染（固定、漂洗、显影和定影等步骤）、EB（每100 mL 1×TBE 中加 20 uL 10mg/mL 的 EB 溶液）、我们公司低毒核酸染料 DNAgreen（每 100 mL 1×TBE 中加 10 uL DNAgreen 原液）。

UV 下观察并拍照。

2. miRNA 回收：按上法用 EB 等染料染色后，UV 下确定所需要的 miRNA条带的位置，切胶后进行胶回收处理。

3. Northern 杂交：按上法用 EB 等染料染色后，UV 下确定所需要的miRNA条带的位置，切胶后电转移到带正电的尼龙膜上，然后进行杂交处理。

4. 放射自显影：如果 miRNA 样品电泳前经过同位素标记，则将凝胶一面的玻璃板揭开，用滤纸将附着在另一玻璃板上的凝胶吸附过来，然后包上保鲜膜，真空抽干，然后使胶跟 X 光片向对置进行放射自显影。