储存条件：

试剂AB 于2-8℃保存，长期存放于-20℃保存；

试剂D 于2-8℃保存

试剂C 和E 室温保存；

蛋白酶抑制剂-20℃保存。

有效期：

一年。

注意事项：

● 本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。

● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。

● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。

● 使用性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。

● 避免皮肤或粘膜与试剂接触。

产品简介：

????线粒体膜蛋白/胞浆蛋白提取试剂盒提供全套试剂，适用于从各种原代或传代细胞和各种实体组织，如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等哺乳动物组织中提取线粒体膜蛋白和胞浆蛋白。提取过程简单方便。制备的线粒体蛋白不仅纯度高，保持天然活性，而且绝少交叉污染。提取的蛋白可用于Western Blotting、转录活性分析、Gel shift 凝胶阻滞实验、免疫共沉淀、酶活性测定等蛋白研究。

本试剂盒提取的蛋白不可用于2D 电泳。

产品特点：

1、使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。

2、含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。

3、紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。

4、蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含7 种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。

该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

试剂盒以外自备试剂和仪器

● 移液器、吸头 ● 离心机及离心管

● 涡旋振荡器 ● 冰箱，冰盒

使用方法：

使用注意事项：

?? 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

?? 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。

?? 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。

?? 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。

?? 使用 Dounce 匀浆器匀浆，如果没有Dounce 匀浆器，用普通1ml 玻璃匀浆器匀浆也可。也可采用超声破碎的方法，建议功率30w，10s。采用普通匀浆器或超声破碎，建议镜检，保证细胞80%以上的破碎率。

?? 每 200ul 试剂C 和试剂D 加入2ul 蛋白酶抑制剂混合物混匀备用。

1. 取 2×107 个细胞①，在4℃，500×g 条件下离心2-3 分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。

2. 用冷 PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。

3. 加入 200μl 冷的试剂 A，置冰上10 分钟。

4. Dounce 匀浆器匀浆30-40 下，然后在4℃，500×g 条件下离心5 分钟。

5. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管。

6. 在 4℃，11000×g 以上条件下离心20 分钟。

7. 取步骤 6 的上清于另一干净离心管中，加入200ul 试剂C 混匀，在4℃，11000×g 以上条件下离心5 分钟，取上清，即得胞浆蛋白。

8. 在步骤 6 的沉淀中加入200μl 冷的试剂B，混匀。

9. 在 4℃，11000×g 以上条件下离心20 分钟。弃上清。

10. 在步骤 9 沉淀中加入加入200μl 冷的试剂 D，2ul 蛋白酶抑制剂混合物，高速涡旋振荡15 秒，置冰上15-20 分钟，每隔5 分钟涡旋振荡15 秒。

11. 37℃水浴10 分钟。

12. 37℃下②2000g 离心5 分钟，此时溶液分为两层（对着光线看），下层约为20μl。

13. 小心吸取上层丢弃或者小心吸出下层。

14. 用 80-150ul 稀释液E 稀释所得的下层部分，即得线粒体膜蛋白。

15. 将上述蛋白提取物定量③后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验④。

注：

① 细胞数量根据实验情况调整，每次的裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。

由于膜蛋白含量较少，需要较多的细胞才能保证得率。

② 必需保证在37℃左右下离心，至少确保30℃以上。无可控温的离心机时，用常温的离心机在室温离心即可，适当缩短离心时间至2-3 分钟。

③ 用BCA 法进行蛋白定量。

④ 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。