产品特点：

本试剂盒是结合植物叶绿体纯化试剂盒和柱式植物DNA抽提试剂盒而推出的新兴产品，专门用于植物叶绿体DNA的快速提取。它具有下列特点：

1. 纯度高，不含污染和抑制剂，可以直接用于酶切、PCR、real-time PCR、 multiplex PCR、RAPD、RFLP、AFLP、Southern Blotting, microsatellite analysis等各种后续分子生物学实验，不会发生离心柱堵塞现象。

2. 产率一般在1-2 ug/1 g叶片样品。OD260/280一般在1.8以上。DNA片段长度一般在40-50 Kb左右。

3. 本产品足够15次提取，每次可处理30g叶片。

4. 已经成功用于菠菜，大豆，莴笋，白菜，烟草和甜菜等双子叶植物，也适用于单子叶等其他植物（可能需要优化条件）。

常温运输，4℃保存, 保存期限一年

使用方法：

注意：叶绿体对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行，所用器皿和溶液均需要在4℃预冷。离心时一定要在4℃进行，离心力以g而不是rpm

计算。如果需要研究叶绿体的功能，提取还需要在昏暗的光线条件下进行。强烈建议用显微镜监控整个过程中叶绿体的回收情况。

一：叶绿体的纯化

1. 实验前1-2天将植物放在暗室培养以减少叶绿体中淀粉颗粒的形成，否则离心时这些颗粒很容易使叶绿体破裂。叶片在实验前需先用自来水洗净，再用蒸馏水淋洗，去掉多余水分。如果叶片采集后不能立即处理，则保存时需要保持叶片湿润，即使如此，叶片的放置时间也不能超过一天。

2. 新鲜（实验当天）制备匀浆液：将自备的去离子水与匀浆液成分一按4：1的比例混合，然后在混合液中加入匀浆液成分二干粉到终浓度0.1%（每100 mL中加入0.1 g干粉），摇晃溶解后所得溶液即为匀浆液，冰上预冷待用。实验（从30 g叶片提取叶绿体）所需要的匀浆液体积随材料不同而异。

3. 新鲜采集植物叶片，快速去除叶脉并将叶片剪成1-3 cm2大小的碎片并浸泡在适量的预冷的匀浆液中（每克叶片加4 mL匀浆液，但对烟草和大豆，每克叶片需要加6 mL匀浆液）。

4. 将浸泡了叶片的匀浆液转移到Waring匀浆机（即家用制备果汁的匀浆机）中，低速匀浆10秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入匀浆机底部后，再低速匀浆10秒。注意：除Waring匀浆机外，还可以选择Dounce玻璃匀浆器，Polytron匀浆机和研磨（加玻璃珠）等裂解细胞的方法，但这些方法的单次处理量都比较小，需分成很多小份单独匀浆，然后再汇集。

5. 用带柄尼龙滤膜过滤匀浆液，可先将滤液收集到预冷的200 mL量筒中，再等分到4个预冷的50 mL的塑料离心管中（每个管中的滤液不要超过35 mL）。带柄尼龙滤膜后可反复使用。

6. 在水平转子离心机上4℃ 200 g离心3分钟（对菠菜，白菜和莴笋材料）或400 g离心1分钟（对甜菜材料），白色沉淀为未破裂的细胞或细胞核。其他植物材料则需要用户自己摸索离心力。

7. 将上清液（含叶绿体）转移到一个新的、预冷的50 mL塑料离心管中。

8. 在水平转子离心机上4℃ 1000 g离心7分钟，小心弃上清，沉淀含叶绿体。

9. 在沉淀中加入1.5 mL预冷的匀浆液，手弹离心管底部使叶绿体重悬。注意：重悬时避免溶液起泡，也不要用枪头吹打，否则叶绿体容易破裂。沉淀下有白色淀粉属于正常现象，但重悬叶绿体时避免将白色淀粉重悬。

10. 将4管叶绿体重悬液汇集（共约6 mL），得到叶绿体粗提液，如果直接用于

叶绿体DNA纯化（容易有细胞核DNA污染），则在水平转子离心机上4℃ 1000 g离心7分钟，小心弃上清，沉淀为叶绿体，用于DNA纯化。

11. 如果需要无污染的叶绿体DNA，就需要用40% Percoll密度梯度离心法将完整的叶绿体和其他污染物进一步分离。具体操作步骤是：在50 mL塑料离心管中先加入6 mL匀浆液成分一和4 mL的Percoll，充分混合均匀得到40%的Percoll溶液。在其液面上小心铺上6mL的叶绿体粗提液。在水平转子离心机上4℃ 1700 g离心6分钟，管底绿色沉淀为完整的叶绿体，液面的绿色部分为破碎的叶绿体。小心将上清倒出后，用于叶绿体DNA纯化。

二：叶绿体DNA的纯化（溶液A和溶液B容易产生沉淀，溶液B十分粘稠，均需65℃溶解并摇匀后再使用）

12. 将600 uL预热的溶液A加入到叶绿体沉淀中后充分吹打混匀。

13. 加入300 uL 预热的溶液B，震荡混匀10-30秒。注意：溶液B非常粘稠，可以采取称量方法取用或将1 mL 枪头剪去一截再吸取。

14. 65℃放置3-5分钟。如果室温放置，DNA产量会降低10-20%。

15. 加入200 uL自备氯仿，震荡混匀10-30秒。

16. 12,000 rpm室温离心2分钟。此时上清液将变得透明，中间层有白膜。小心转移上清液（约0.8 mL）到一个新的3-5 mL离心管中，避免触及中间层的白膜，可留少量上清不取。

17. 加入1.5倍体积(约1.2 mL)的溶液C，颠倒混匀后先转移0.7 mL到离心吸附柱中，室温放置至少2分钟。12,000 rpm室温离心1分钟，DNA将吸附在离心吸附柱的膜上，倒弃收集管中的穿透液。

18. 再将剩余的溶液按上步方法上柱。

19. 将0.5 mL通用洗柱液加入到离心吸附柱中，12,000 rpm室温离心1分钟，弃穿透液。

20. 重复上步操作。空甩半分钟去除残留液体。

21. 将离心吸附柱放置在一新的1.5 mL塑料离心管中，加50-100 uL DNA洗脱液2.0，室温放置3-5分钟。

22. 12,000 rpm室温离心1分钟即得植物叶绿体DNA溶液。

23. 重复上步操作，直接取5-10 uL电泳检测，其余放冰箱备用。