产品特点：

线粒体是重要的、负责能量产生的极其重要的细胞器。对丝状真菌线粒体进行生化，遗传和分子生物学研究都需要先进行线粒体纯化。本产品就是基于密度梯度离心的，专门用于从丝状真菌叶片中纯化完整线粒体、再从中纯化线粒体DNA的试剂盒。它具有下列特点：

1. 即用型试剂盒，用户不需要单独配制各种溶液。

2. 所得线粒体可用于后续的SDS-PAGE、Western、ELSIA、蛋白组分析、线粒体DNA和线粒体RNA纯化。

3. 本产品足够15次线粒体纯化和15次线粒体DNA提取，每次可处理10-20g菌丝体，能得到1-5 mg左右线粒体。

4. 已经成功用于Aspergillus candidus、Aspergillus nidulans、Magnaporthe oryzae、Neurospora crassa、Penicillium chrysogenum、Rhizopus stononifer等丝状真菌。

常温运输和保存, 保存期限一年。

使用方法：

注意：纯化DNA提取用的线粒体的要求比纯化功能研究用的线粒体的要求要低，但整个操作还是在冰上或者在冷室进行，所用器皿和溶液在4℃预冷，离心要在4℃进行，离心力以g而不是rpm计算。

一：菌丝的摇瓶培养

1. 使用合适的丝状真菌培养基，接种孢子至终浓度为2×10E6/mL。一般100 mL液体培养基可以得到0.8-1.2g菌丝体，而本方法可以处理10-20g菌丝体，故培养1-2升。

2. 在合适的温度（如25℃、30℃或37℃，根据真菌不同而不同）250rpm/min摇晃培养16-20小时。

3. 用多层纱布或多层过滤纸过滤收集菌丝，用冰浴的自备去离子水洗涤菌丝三次去除残留的培养基。

4. 用吸水纸吸干菌丝的水分，称重后立即使用。如果在-80℃或液氮长期放置，线粒体回收效率将减低。

二：线粒体粗提液的制备

5. 制备溶液A工作液：每次提取需150mL溶液A工作液，制备方法是将20mL溶液A和130mL自备去离子水混合，冰上预冷即可。

6. 在200mL烧杯中，加入100mL预冷的溶液A工作液，再加入新制备的菌丝体，然后全部转移到Waring匀浆机（家用果汁匀浆机）中，低速匀浆10秒，避免起泡沫。用玻璃棒把菌丝按入匀浆机底部后，再低速匀浆10秒。注意：还可以选择Dounce玻璃匀浆器，Polytron匀浆机和研磨（加玻璃珠）等方法，但它们单次处理量一般都较小，需多份处理再汇集。

7. 用带柄尼龙滤膜过滤匀浆液，用预冷的200 mL量筒收集穿透液。

8. 将剩下的菌丝体转移到Waring匀浆机中，再加入40 mL预冷的溶液A工作液，低速匀浆10秒，用上步的带柄尼龙滤膜过滤，用预冷的200 mL量筒收集穿透液。注意：带柄尼龙滤膜后可反复使用。

9. 将穿透液分到4个预冷的50 mL的塑料离心管中（每个约35 mL）。

10. 在水平转子离心机上4℃ 4000 g离心10分钟，小心转移上清（含线粒体的部分）到4个新的离心管中。沉淀含细胞核和未裂解的细胞，可以弃之不用。如果要用于纯化细胞核DNA，则可以放-80℃长期保留。

11. 将含上清液的4个离心管在4℃ 10000 g离心20分钟。

12. 每个离心管中加2.5mL预冷的溶液A工作液重悬线粒体沉淀并汇集（共约10 mL），此为线粒体粗提液。

13. 如果直接用线粒体粗提液提取线粒体DNA，容易有细胞核DNA污染。具体步骤是：在水平转子离心机上4℃ 10000 g离心7分钟，小心弃上清，沉淀为线粒体，直接用于第三步的线粒体DNA提取。

14. 如果需要高纯度、无污染的线粒体DNA，则需要用密度梯度离心法将完整的线粒体和其他细胞碎片进一步分离。具体见下步线粒体精提液的制备。

三：线粒体精提液的制备（密度梯度离心法）

15. 制备重液和轻液：将4.1克成分B干粉加到6.3 mL溶液C中，充分摇晃混匀得10 mL重液。将4.1克成分B干粉加到6.3 mL去离子水中，充分摇晃混匀得10mL轻液。

16. 在50 mL塑料离心管中先加入10 mL重液，再在其上轻轻加上10 mL轻液，加上第11步所得的约10 mL线粒体粗提液。

17. 加平衡离心管后在水平转子冷冻超速离心机上4℃ 43000 g离心2小时，重液和轻液间的带为完整线粒体。

18. 用广口吸管小心将线粒体转移到新的离心管中，加入等倍体积的预冷的溶液C，轻柔混匀。取少量在相差显微镜下检查线粒体完整性。

19. 在水平转子离心机上4℃ 19000 g离心20分钟，小心将上清吸出后，线粒体沉淀可以直接用于DNA提取。

四：线粒体DNA提取

20. 将600 uL通用线粒体DNAout溶液A加入到上步得到的线粒体沉淀中并吹打混匀，然后转移到1.5 mL离心管中。

21. 65℃放置5分钟。

22. 加入300 uL 通用线粒体DNAout溶液B，震荡混匀10-30秒。注意：溶液B非常粘稠，可以将其预热到65℃并剪掉一截枪头后再取。

23. 加入200 uL自备的氯仿，震荡混匀10-30秒。

24. 12,000 g室温离心3分钟。此时上清液将变得透明，中间层有白膜。

25. 小心转移上清液（约0.8 mL）到一个新的1.5 mL离心管中，避免触及中间层的白膜，可留少量上清不取。

26. 加入1倍体积的通用线粒体DNAout溶液C，颠倒30次混匀。

27. 12,000 g室温离心5分钟，小心弃上清液。

28. 在离心管中加入1 mL自备的 75%乙醇，震荡30秒。

29. 12,000 g室温离心1分钟，小心弃上清液。

30. 12,000 g室温离心半分钟，残留液体将汇集在管底。

31. 用洗液枪吸弃管底残留液（约50 uL）。

32. 加50-100 uL 自备的TE缓冲液，溶解DNA沉淀即得线粒体DNA溶液。直接取5-10 uL电泳检测，其余放直接使用或放-80℃冰箱备用。