非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)是目前电泳法分离活性蛋白的主要方法之一，跟SDS-PAGE根据分子量大小分离蛋白质不同，它是根据蛋白质分子大小、形状、电荷密度三个主要参数分离蛋白质。由于蛋白质的pI各不相同，所以对不同蛋白质需要选用具有不同pH的电泳体系。单独配制不同pH的Native PAGE电泳胶十分繁琐，为此本公司开发了本产品。它有下列特点:

1. 即开即用，用户不需单独准备各种成分，十分方便。还免去了实验人员接触粉末状的剧毒物品丙烯酰胺

2. 非变性，电泳过程中蛋白质保持天然的构象和亚基之间的相互作用，得到的蛋白质一般都具有生物活性（而SDS-PAGE得到的蛋白没有活性）。

3. 可以用于分析蛋白质和DNA或RNA的相互作用、蛋白修饰、蛋白构型改变、回收有活性蛋白质等试验。

4. 电泳后可直接用于考染、银染、Western杂交等实验。

5. 提供具有3种不同pH的缓冲液套装，便于客户选择适合的缓冲液体系。

常温运输和保存（上样液需-20℃保存），保存期为一年。

使用方法：

特别说明：如何选择缓冲液

高pH浓缩胶，高pH分离胶，高pH电泳液和高pH上样液一定要配套使用。中pH和低pH系列也是如此，绝不能高pH的成分跟其他pH的交叉使用。选择适当pH的缓冲液（包括上样液，电泳液，配胶液等）对蛋白质非变性PAGE非常重要，缓冲液的pH又跟目的蛋白质的pI值密切相关。如果pH远离pI，则蛋白质分子带电多（电荷密度大），电泳速度快，分辨率高。但过酸过碱又容易使蛋白质结构变性，失去活性，所以pH条件就是在电泳分辨率和维持活性之间寻找平衡，需要针对每种蛋白质进行摸索或通过滴定曲线来确定，没有通用的电泳缓冲体系。由于有近半数的蛋白质pI在4-6.5，所以在不知道目标蛋白的pI时，可以先选用高pH缓冲系统。

一：配制分离胶

1. 确定浓度。对分子量在100Kd以上的蛋白质，可选用3-5%的胶；对分子量在20-150KD之间的蛋白质，可选用5-10%的胶；对分子量在10-80KD之间的蛋白质，可选用10-15%的胶。对未知样品，建议使用7.5%的胶。

2. 配制10%的APS（过硫酸铵）：按每0.1克过硫酸铵干粉加1 mL去离子水的比例配制10%的APS溶液，该溶液可以在4℃存放一周。

3. 配制30%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺（19:1）溶液:在本产品提供的装有60克丙烯酰胺干粉的塑料瓶中加入146 mL自备的去离子水和3g甲叉双丙烯酰胺,充分摇晃直到溶解（约需10-20分钟）即得200 mL 30%丙烯酰胺（19:1）溶液。此溶液在一个月内用完，必须4℃避光保存。

4. 配10 mL分离胶(如果配制其他体积,请按比例调节各成分用量): 在一个25 mL的三角瓶中，先加入4.2 mL去离子水、3.3 mL 30%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺（19：1）溶液和2.5 mL 4×分离胶配胶液。

5. 摇晃混匀后抽真空10-15分钟以去除溶液中的氧气（氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应，不去除的话将影响丙烯酰胺聚合反应）。

6. 加入50uL新配制的10%APS和10uL TEMED（这是配制10 mL胶的用量，配制更大体积的胶则按比例增加），迅速摇匀后倒胶。注意：如果购买的是低pH缓冲系统，由于在低pH缓冲液中PAGE聚合速度降低，所以需要增加上述两成分的用量。

7. 在胶面距离顶部1-1.5 cm的时候停止灌胶。然后覆盖一层1-5 mm厚的水，使胶顶部液面平整。由于比重不同，水和丙烯酰胺溶液不会混合。

8. 室温聚合30-60分钟后，用1×分离胶配胶液洗涤凝固的胶的顶部，待用。

二：配制浓缩胶（浓缩胶可以提高分辨率，适合于成分复杂的样品，一般使用浓度为4%。使用浓缩胶时蛋白质泳动速度主要跟其尺寸和形状相关。因浓缩胶pH跟分离胶pH不同，蛋白质可能会发生聚合和沉淀。对成分单一的样品，可以不用浓缩胶，此时蛋白的泳动速度主要跟其电荷密度，尺寸和形状相关。）

1. 配10 mL浓缩胶(如果配制其他体积,请按比例调节各成分用量): 在一个25 mL的三角瓶中，先加入6.2 mL去离子水、1.3 mL 30%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺（19：1）溶液和2.5mL 4×浓缩配胶液。

2. 摇晃混匀后抽真空10-15分钟以去除溶液中的氧气（氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应，不去除将影响丙烯酰胺聚合反应）。

3. 按上表用量加入50uL 10%APS和15uL TEMED（这是配制10 mL胶的用量，配制更大体积的胶则用量需按比例增加），迅速摇匀后在已经凝固的分离胶上倒胶。

4. 在液面达到顶部时停止灌胶，插入梳子。

5. 室温聚合30-60分钟，拔出梳子，用1×电泳液冲洗加样孔。

三：电泳

1. 将凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽加入足够1×电泳液。注：本产品提供10升的三种不同pH的电泳液干粉中的一种，低PH和高PH值电泳液用前需将所有干粉溶解在1 L水中得10×电泳液，可以室温放置，用时再稀释成1×电泳液。一般不需要再调节pH，但保险起见，可以用pH试纸测试一下1×电泳液。高中低pH电泳缓冲液的pH分别是8.3，7.0和4.5。

注意：中pH值的电泳液干粉只能配1x电泳液，否则不溶解。称取中pH电泳液（pH 7.0）干粉A, 5.52g, 中pH电泳液（pH 7.0）干粉B 1g混匀，加去离子水至彻底溶解，调PH7.0，定容至1L。客户根据可实际需要量按比例增减。

2. 连接电极。如果浓缩胶和分离胶的pH高于目标蛋白pI，目标蛋白将带负电荷并向阳极移动，可以按标准的SDS-PAGE方法接通电极（上阴极下阳极）；如果浓缩胶和分离胶pH低于目标蛋白pI，目标蛋白将带正电荷并向阴级移动，此时应该下阴极上阳极。

3. 300V预电泳直到电流不再降低（约需要30分钟）以去除残留过硫酸铵。

4. 换电泳液。

5. 在液体蛋白质样品中加入5×上样液（16 uL液体样品加4uL上样液）后上样。0.75 mm厚的胶可以上10 uL，1.5 mm厚的胶可以上20 uL。在未用加样孔中也要加1×上样液以防有样品的空道的样品扩散。注意：如果用考染检测，每个孔的蛋白在50-100 ug总蛋白，如果银染则只需要1ug即可。样品如果是蛋白质沉淀，可用1×上样液直接溶解蛋白质沉淀后再上样。蛋白质溶液或沉淀中不能含有能够改变上样液pH的残留成分（如蛋白质沉淀剂TCA），用前用pH试纸测试一下，不在上样液的pH范围时就用酸或碱调到正常范围。大量样品可用透析法调pH。

6. 上样自备的天然PAGE蛋白质标准或等电电泳的标准品（如果有的话）。

7. 用15 mA（对0.75 mm厚的胶）或30 mM（对1.5mm厚的胶）的电流电泳直到染料移动到分离胶底部。微型胶一般需要1-2小时。注意：电泳过程在冷室或有冷却系统，以免电泳产热使蛋白质变性。

8. 终止电泳，取出凝胶进行后续的实验处理（如染色或酶活性检测）。