产品及特点：

构建cDNA文库、蛋白质的体外翻译和RT-PCR方法检测稀有的mRNA等研究常常需要从总RNA中分离mRNA，mRNA只占总RNA的1%左右，但由于带poly（A）尾巴，所以可以通过与Oligo（dT）纤维素的亲和结合而与其他RNA（如rRNA、tRNA等）分离开。本产品专门用于从动物组织中提取mRNA，它具有下列特点：

1. 一站式，由柱式动物RNA提取试剂和mRNA提取试剂两个产品整合而成，即开即用，非常方便。

2. 可以处理50-100 mg的动物组织，能得到约10-15 ug总RNA，从中可得0.1-0.5 ug 左右的mRNA。

3. Oligo（dT）纤维素吸附能力强，每克可以吸附50-80 OD的mRNA，相当于2000-3000 ug mRNA。

4. mRNA提取过程操作简单，只需要离心就可以完成，免去了常规的灌柱、洗柱等繁琐操作。

5. 得到的mRNA可以直接用于构建cDNA文库、蛋白质的体外翻译和RT-PCR。


常温运输， Oligo(dT)纤维素-20℃保存，RNA洗液4℃保存，其余产品可以室温放置。本产品有效期一年。


使用方法：

一：用柱式动物RNAout提取总RNA

下面的操作步骤是针对在1.5 mL塑料离心管中进行的微量提取的，如果处理样品量大，请按比例增加各成份的用量并使用大的离心管和离心机。

1. 新鲜配制裂解液。将溶液A和溶液B按1:1的比例混合，然后根据组织细胞类型的不同分为下面及种情况使用。注意：溶液A和溶液B混合后必须立即使用，不要放置，否则会产生沉淀。

a) 对贴壁细胞：吸尽培养液，在每10平方厘米细胞中加入1 mL新鲜配制的裂解液，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。

b) 对悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，在每1-5×106悬浮细胞中加入1 mL新鲜配制的裂解液，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。如果是fibroblasts或carcinoma cell，1 mL新鲜配制的裂解液的细胞使用量不要超过1×106个细胞。

c) 对新鲜组织：先将剪切成小块新鲜组织或液氮保存的组织放入10 mL或15 mL塑料离心管中，每50-100 mg组织加1 mL新鲜配制的裂解液，用匀浆器匀浆30秒左右。对肝、脾、胰、肾等细胞分裂十分旺盛的组织（细胞中含大量正在复制的DNA），建议组织的使用量不要超过50 mg/ mL裂解液，否则十分容易产生DNA污染。

d) 对RNALOCKER保存组织：先用纸吸去RNALOCKER液体后再剪切成小块，其余操作同新鲜组织的处理。

2. 将裂解物转移至一个干净的1.5 mL塑料离心管中，然后加入0.2倍体积的自备氯仿(1 mL裂解物需0.2 ml氯仿)，振荡器上充分振荡混均30秒。

3. 12000-15000 g室温离心3-5分钟。

4. 将上清液（约0.6-0.8 mL）转移到离心吸附柱中。注意：离心后下层有机相和中间层含有DNA和蛋白质，避免触及，否则将产生蛋白质和DNA污染。为保险起见，可以留下100 uL上清液不取。同时吸取上清时缓慢进行，否则容易吸出交界面的不可见的丝状DNA。

5. 13000-15000 g室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。

6. 加0.5 mL通用洗柱液到离心吸附柱中，室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。

7. 再加0.5 mL通用洗柱液到离心吸附柱中，室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。

8. 室温离心半分钟。此步十分重要，否则残留的通用洗柱液会影响RNA的使用。

9. 将离心吸附柱转移到一自备的RNase-free收集管中，加入50 uL RNA洗脱液。

10. 室温离心半分钟，离心管中溶液即为RNA样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。

11. RNA完整性的电泳检测：如果需要做Northern杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA分子（BioTechniques，28：414，2000）。

12. RNA产量产率测定：将5-10 μL RNA溶于TE缓冲液中(pH7.5-8.2之间)检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度（1 OD260的RNA=40 μg/mL），进而计算出RNA的产量（浓度X体积)和产率(RNA产量/组织用量)。

13. RNA纯度测定：无污染的总RNA的OD260/OD280一般在1.8-2.1之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响RT-PCR等反应。

二：从总RNA中提取mRNA

本产品提供本产品提供25 mg Oligo(dT)纤维素，每克Oligo(dT)纤维素能够结合50-80 OD的mRNA。

1. 在一个1.5 mL塑料离心管中称取1 mg Oligo (dT)纤维素。将0.5 mL结合液加入到一管装有1 mg Oligo (dT)纤维素的离心管中，混匀后室温放置5分钟。也可以将250 uL 结合液加入到装有25 mg Oligo(dT)纤维素的离心管中，每次取10 uL（相当于1 mg Oligo (dT)纤维素）与0.5 mL结合液混匀，室温放置5分钟。剩余部分放-80℃保存。

2. 200-2000 g离心30秒，小心吸弃上清后留Oligo (dT)纤维素沉淀待用。

3. 将在节中提取的两管相同的总RNA（每个样品用50 uL洗脱）混合在一起得到总RNA 100 uL，65℃加热 5分钟。

4. 加入等体积的结合液，混匀后冷却到室温后，全部转移到装有Oligo(dT)纤维素的离心管中，

5. 混匀后室温放置5分钟，期间颠倒混匀数次。

6. 4℃ 200-2000g 离心5分钟，小心将上清转移到一个离心管中。此上清液是去除了mRNA的总RNA。冰上放置待用。

7. 加入0.5 mL结合液，混匀后4℃ 200-2000g 离心5分钟，小心弃上清。

8. 重复上步2-4次。

9. 加入50 uL RNA洗脱液，混匀后4℃ 200-2000g 离心5分钟，小心收集上清（mRNA）。

10. 重复上步1-3次。

11. 将各次收集的mRNA混合。

三：用微量核酸沉淀剂沉淀mRNA

1. 按2:1的比例将微量核酸沉淀剂与mRNA溶液混合。微量核酸沉淀剂用前需要摇匀。

2. 室温15000 g离心10分钟(如果mRNA含量在2 ng以下，建议离心30分钟)。

3. 小心弃上清后，加入1 mL自备的75%乙醇，振荡混匀。

4. 15000 离心3-5分钟，小心弃上清。

5. 再短暂离心后小心吸弃上清，沉淀即为回收的mRNA沉淀，可溶于TE或RNA洗脱液中待用。