产品特点：
线粒体是非常重要的细胞器，它不但跟人类很多疾病相关，而且还是母系遗传研究的重要材料。
对线粒体进行遗传研究和生化研究都需要纯化线粒体。本产品是可用于纯化动物细胞线粒体的试剂
盒。它具有下列特点：
1、即开即用，优化各种条件。
2、有粗提和精提两个选择，但是精提需要超速离心机。粗提所得线粒体可直接用于蛋白分析
（SDS-PAGE、Western Blot、ELISA 等）、蛋白组分析和线粒体DNA 纯化。精提线粒体可以
用于偶联分析和体外线粒体蛋白合成实验。
3、本产品可以处理约2×108 个培养细胞,30mg 培养细胞(相当于15 瓶150mm 培养细胞)
可以纯化得到0.5～1.5mg 线粒体。
4、本产品适用于各种动物悬浮培养细胞和贴壁培养细胞，不能用于动物实体组织。
5、提供线粒体染液，可以在操作时随时监测纯化过程中线粒体的完整性。
常温运输和保存，保存限期一年。
使用方法：
注意：线粒体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或者冷室进行，所要用到的溶液和离心
管都必须预先冷却，否则线粒体容易破裂。
一、准备工作
1、将溶液A 和溶液B 放冰上预冷待用。
2、配置1.7M 高比重溶液：将36 克蔗糖用溶液B 溶解并定溶到60mL，冰上预冷待用。
3、配置1M 低比重溶液：将51 克蔗糖用溶液B 溶解并定溶到150mL，冰上预冷待用。
4、配置线粒体重悬液：将225mL 溶液B 和75mL 的1M 低比重溶液混合，冰上预冷待用。
二、线粒体粗体
1、如果提取材料是单层细胞，先用60mL 自备的PBS 缓冲液洗涤2×108 个培养的单层细胞，共洗
涤2 次。然后用塑料刮匙刮下细胞，重悬在60mL PBS 缓冲液中。如果是悬浮细胞，则1000g 4℃
离心10 分钟收集2×108 个细胞，再用60mL PBS 缓冲液洗涤2 次，将细胞重悬在60mL PBS
缓冲液中。
2、用平甩转子（swinging-bucket rotor）离心机1000g 4℃离心10 分钟，吸弃上清，保留细胞沉淀。
3、加入5 倍体积(以细胞沉淀的体积为基数)的预冷的溶液A，轻柔重悬细胞。
4、冰上放置4-5 分钟。注意：冰浴时间不要超过5 分钟。
5、如果是成纤维细胞，由于其难以裂解，可将细胞重悬液在-80℃放置20-30 分钟后再化冻，然后
进入下步操作。如果不是成纤维细胞，则直接进入下步操作。
6、将细胞重悬液体转移到预冷的Dounce 玻璃匀浆器中（工作体积为10-15 mL，间隙为0.12 mm，
是玻璃材质，否则线粒体产率会降低）匀浆适当次数。细胞株不同，其适匀浆次数不同，
一般需要40 次-60 次左右。匀浆是线粒体纯化关键的步骤，故匀浆前先通过预实验确定
适匀浆次数，方法是每匀浆5-10 次后，取2-3 uL 匀浆液到载玻片上，然后在相差显微镜下观
察，完整细胞数量降低到20%以下为佳。
7、加入1/3 体积的、预冷的1.0 M 低比重溶液，轻柔混匀。
8、用平甩转子离心机4℃ 1000 g 离心10 分钟。沉淀含残留完整细胞、细胞碎片和细胞核，上清
液含线粒体。
9、转移上清液到离心管中，冰上放置。在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先
滴50uL 左右上清液到载玻片上，再滴入50 uL 詹纳斯染液绿B 染色液20 分钟，油镜下观察，
蓝绿色颗粒状物即为线粒体。
10、用固定角度转子（fixed-angle rotor）离心机4℃ 15000 g 离心15 分钟，弃上清，所得棕黑色沉
淀即为粗提线粒体沉淀。
11、用10 mL 线粒体重悬液重悬线粒体，4℃ 15000 g 离心15 分钟，弃上清。
12、重复上步。
13、用适量的线粒体重悬液重悬线粒体，可用于各种后续实验（本试剂盒不提供相关试剂），
如果用于下面的精提操作，则用10mL 线粒体重悬液重悬。
三、线粒体精提
1、在跟超速离心机匹配的50 mL 的离心管中，加入10 mL 预冷的高比重溶液，再在上面加上10 mL
预冷的低比重溶液，再加上10 mL 线粒体粗提液。
2、70000g 4℃离心40 分钟，线粒体将位于高比重溶液和低比重溶液之间区域。
3、小心用广口吸管吸出线粒体到新的离心管中，加入等体积的线粒体重悬液。
4、用平甩转子（swinging-bucket rotor）离心机1000 g 4℃离心10 分钟，吸弃上清，保留线粒体沉
淀。
5、用10 mL 线粒体重悬液重悬线粒体，在平甩转子离心机上4℃ 1000 g 离心10 分钟，吸弃上清，
保留线粒体沉淀。
6、再重复上步。
7、用适量线粒体重悬液重悬线粒体，得到线粒体精提液。可以直接用于Lowry 法蛋白浓度测
定，也可以用于其他后续实验。