产品特点:
易错PCR(error-prone PCR)是利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的特性,在一定条件下(如不同的dNTP浓度、Mg浓度和MnCl2存在)能够按较高的机率引入随机引入突变。如果有适当的选择方法,则可从构建的突变库选出所需突变体。
本产品是在本公司的易错PCR试剂盒基础上改进而得,本产品具有下列特点:
1. 即开即用,十分简单方便,尤其在生物制药和酶学研究领域显示出了它的优越性。
2. 配方经过精心优化,实验人员在一定范围内可以控制突变率,一轮PCR的突变率范围在2-8突变/1000bp,更高的突变率可以通过多轮PCR达到。
3. 可用于连续易错PCR(sequential error-prone PCR),只需把上易错PCR的产物用作下易错PCR的模板即可,使每获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
4. 可以扩增的DNA片段更长,达到3kb,对于3kb以上的产物,建议分段扩增。
低温运输,-20℃保存, 有效期为一年。
使用方法:
1. 将模板DNA稀释到1ng/uL。将引物稀释到10uM。注意:引物是决定易错PCR成败的关键因素,设计引物时要保证其Tm在70℃,长度在25-30nt之间,GC含量在45%-60%之间,3端GC含量低,并且没有发夹结构。
2. 根据每1000bp的预期突变数按下表确定易错PCR的反应条件中MnCl2和dGTP的用量。
3. 以30 uL的标准PCR反应体系为例,如果反应体系不是30 uL,各成分需要按等比例增加或减少
4. 按已经优化的PCR条件进行一定循环数的PCR(循环数与突变率的关系见下表),然后取5 uL电泳检查。
注:易错PCR一般不需要热启动,也不需要在PCR结束后做延伸处理。长度每增加1Kb,时间延长1分钟。易错PCR循环次数决定每个核苷酸位置的突变几率,进而决定每个PCR产物可能的突变位点数,所以所需循环数由客户根据需要改动。
5. 电泳检测是否得到预计长度的PCR产物。
6. 克隆片段进行功能筛选、或者克隆后进行测序分析突变率、或者用此轮PCR的产物为模板,进行下一轮的易错PCR。