产品特点:

端粒酶存在于85-90%的肿瘤组织中,因此通过检测端粒酶活性就能早期诊断大多数肿瘤。目前常用的检测端粒酶活性的方法就是TRAP (telomeric repeat amplification protocol,端粒重复片段扩增),它利用端粒酶能在外加的TS模板DNA的末端添加不同数量的TTAGGG序列这一特点,通过PCR检测延伸产物而高效检测端粒酶活性。本品是百奥莱博公司在经典TRAP技术基础上改良而得,专门用于快速测定人类细胞端粒酶的相对活性(需要跟对照样品比较)。它具有以下特征:

1. 一站式,提供从细胞裂解到PCR的所有试剂,但不含PAGE和银染试剂。

2. 一管式操作,端粒酶延伸和PCR在同一体系中完成,方便快捷。

3. 提供改良的、长为150 bp的内参和含8个端粒序列的合成端粒,可有效排除PCR假阴性。内参长度远大于TRAP产物,不会干扰结果分析。

4. 改良的TS模板和PCR引物,极大降低了引物二聚体的形成。

5. 既可用于培养细胞,也可用于实体组织。

6. 灵敏度高,可以检测到10个肿瘤细胞中的端粒酶活性。

低温运输,-20℃保存,有效期一年。

使用方法:

一:端粒酶的提取

注意:端粒酶是蛋白质和RNA组成的复合体,RNA极容易被降解,因此,提取端粒酶应该跟提取RNA一样,尽量在低温条件下快速操作,并且必须使用RNase-free的耗材,桌面用固相RNase清除剂清洁(CAT#:BTN3090)清洁。

1. 对冷冻的实体组织:将50-100 mg冷冻组织在液氮中用预冷的研磨器研磨成粉末,再转移到预冷的玻璃匀浆器中,加入200 uL 预冷的TRAP细胞裂解液,温和手动匀浆数次后冰浴30分钟,每间隔数分钟涡旋振荡,共5-6 次,然后直接进入第3步操作。为保证裂解效果,可在显微镜下观察。如果组织样品不足50-100 mg,可以按比例降低TRAP细胞裂解液的用量。

2. 对新鲜的培养细胞和组织:用自备的预冷PBS洗涤105-106个经过胰酶处理的细胞或50-100 mg新鲜组织,3000 g 4℃离心5分钟,弃上清;加入200 μL预冷的TRAP细胞裂解液悬浮细胞或组织。对细胞:涡旋振荡10秒后置冰浴30分钟,每间隔数分钟涡旋振荡,共5-6 次。对组织:在冰上用玻璃匀浆器轻柔匀浆后冰浴30分钟,每间隔数分钟涡旋振荡,共5-6 次。如果细胞不足1×106或50-100 mg,可按比例降低TRAP裂解液的用量。

3. 12000-14000 g 4℃离心20分钟。

4. 收集160 uL上清,先取部分用于测定蛋白质浓度,可通过测定215nm和225nm的光吸收得到,计算公式是蛋白质浓度(ug/uL)=0.144×(A215-A225)×稀释倍数,也可使用BCA法测定蛋白浓度。本试剂盒制备的细胞裂解物的蛋白浓度一般在10-750 ng/uL。知道各样品的蛋白浓度后,可用TRAP细胞裂解液将各样品的蛋白浓度调成一样便于比较,然后按10 μL/管分装得到至少15管裂解物,放-80℃冷冻保存(可存放一年)。每个样品可取一管进行热灭活(95℃处理10分钟)后再放-80℃冷冻保存,此管将作为该样品的阴性对照。

二:TRAP反应

5. 确定每个TRAP反应的细胞裂解物用量:为便于分析比较,每个TRAP反应所用的蛋白量(或细胞数)必须一样。由于细胞裂解物中一般都有高浓度的不明Taq DNA聚合酶抑制物(TRAP失败常见的原因),因此结果往往是用稀释10-1000倍后的细胞裂解物得到。建议用一个样品稀释不同浓度做TRAP预实验。

三:PAGE-银染检测及结果解读(本试剂盒不含PAGE-银染检测试剂盒)

8. 取5uL PCR反应液进行10%非变性PAGE电泳-银染显色实验(需另购本公司PAGE电泳套装和银染试剂盒)。如果背景高(主要是由反应体系中的蛋白成分引起),可以先进行PCR产物纯化再进行PAGE电泳和银染。